贝赛尔特学习园地|陈朝熙:支原体检测

支原体检测

支原体(mycoplasma)属于细菌域原核生物界硬壁菌门中低 c、G含量的革兰阳性杆菌分支柔膜体纲(Mollicutes)，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物 ，大小介于细菌与病毒之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。在细胞培养过程中，支原体感染发生率达30％～60％，随着细胞培养技术的广泛应用，组织、细胞、疫苗等受支原体污染的现象越来越普遍。

污染细胞最常见的支原体包括：发醉支原体（M.fementans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（ M.orale ）、精氨酸支原体（ M.arginina ）、梨支原体（M.pirum）、唾液支原体（M.salivarium）和人型支原体（M.hominis）。被这些支原体污染的细胞常常不引起明显的细胞病变，也不导致培养液浑浊，难以凭肉眼发现，因此，建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。

支原体的检测方法有很多种，《中国药典》中支原体检测方法包括培养法、DNA荧光染色法，其他方法还有酶法、PCR法、ELISA法、间接免疫荧光试验、生化检测法、直接血凝试验、探针法、放射自显影法等。每种方法各有利弊，不同方法的支原体检出率也有差别，一般在5％ ～87％之间。本次讲述培养法、DNA荧光染色法、PCR法检测。

1、培养法

方法：配制支原体培养基，取1 mL细胞培养液，接种于液体培养基中，37 ℃培养，同时观察是否有混浊或pH值改变。2周后，分别取0.1 mL液体培养液涂在琼脂平板上，倒置于37 ℃厌氧箱培养，至少3周，持续观察是否有支原体菌落出现，有圆形无色透明菌落出现为阳性。

评价：此法是较早采用的方法。在固体琼脂培养基、半固体或液体培养基上培养 Vero、NIH3T3 等易被支原体污染的细胞株，可在其中分离到支原体菌株。培养法得到支原体菌株是最可靠的阳性指标。该方法的缺点是灵敏度低，不能检测到种属且不适用于检测所有支原体。

2、DNA荧光染色法

方法：

①制备标本。首先，在六孔板中制备盖玻片细胞培养物，然后将待测细胞接种到盖玻片上，用培养液培养 1 ～ 2 d。采用有支原体污染的细胞作阳性对照，无支原体污染的细胞作阴性对照。

②固定。首先，吸出培养液，用新鲜配制的 1∶3冰醋酸 /甲醇固定液固定 15 min；然后，吸出固定液后重复固定一次；最后，吸除固定液室温下干燥。

③染色。用 pH值 7.2的 PBS稀释Hoechst33258储存液，使终浓度为 5μg/ml；然后将染液滴加到固定好的细胞上，室温下避光染色 30 min。

④洗涤。用双蒸水浸泡染色过的盖玻片 3次，每次 3 ～ 5 min。⑤封片。滴加 1滴含 50%甘油的柠檬酸缓冲液( pH值 5.5)到染色过的细胞表面，然后将盖玻片上有细胞的一面朝下，覆盖在载玻片上。⑥观察。在荧光显微镜下观察细胞的荧光分布状态，判断有无支原体污染及污染程度。

评价：利用荧光燃料 Hoechst33258 能与DNA 特异性结合的性质，在荧光显微镜下观察被支原体污染的细胞时，除细胞核外，在细胞膜上及细胞之间也有荧光颗粒。荧光染色法分为直接法和间接法两类，直接法即用染色剂将待测细胞直接染色；间接法指在无污染指示细胞中加入待测细胞上清液，进行混合培养后再染色，因此间接法的灵敏度高于直接法。

3、PCR法

方法：采用酚氯法提取待测细胞DNA，引物为常见污染支原体种类16sRNA的保守区域序列，长度472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。PCR总反应体积为25 μL，加入PCR缓冲液、氯化镁、Taq酶、dNTP、模板和引物。扩增条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性25 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 循环30次后，72 ℃恒温7 min。取9 μl扩增产物与1 μl 10×Loading Buffer混合后，加入含0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶，75V电泳25 min，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，有目的片段出现为阳性。

评价：PCR 法是目前常用的支原体污染检测方法，其原理是根据具有支原体种或属特征的核酸序列（一般用 16S rRNA）设计引物，经预变性、扩增、延伸后得到扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳实验后，通过凝胶上条带的位置进行判断待测物是否感染了支原体。PCR 法灵敏度高，检测时间短，操作简便，但仍然存在一定缺陷：如易出现假阳性或假阴性等。近年来出现了两步法 PCR 检测支原体污染的方法，即在第一次 PCR 的基础上，再进行第二次 PCR。其原理与 PCR 理相同，只是分别采用外引物 (outer p rimer) 和内引物 (inner primer) 分两轮进行扩增，相对于传统 PCR 法而言，其准确性、特异性和灵敏度均有所提高。

细胞制剂质控标准检测项目至少包括内毒素检测、无菌检测、支原体检测、细胞数量、细胞存活率、细胞表型等的检测。支原体检测在质检中也具有很重要的地位。支原体感染细胞后一般难于清除，事实上，被支原体污染的细胞，即使污染被清除，细胞原有的生物学特性，如基因的表达、抗原性和代谢特点也随之发生了相应的改变，会对研究结果造成严重影响。为了保证细胞体系免受污染的影响，关键是加强预防尽可能减少污染的发生，一般需要在培养液中加入抗生素；另外，清洁的实验室环境和良好的操作习惯，优质的试剂，如血清、培养基等都是很重要的。