北京大学医学部鲁凤民实验室
在感染肝细胞内，乙型肝炎病毒（HBV）复制的模板为cccDNA。HBV cccDNA相对稳定，平均每个感染肝细胞内的cccDNA拷贝数为5~50个，其持续存在与病毒感染的持久性密切相关。慢性HBV感染可引起慢性乙型病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化（肝衰竭）甚至肝癌。我国是HBV感染的中高度流行区，HBV携带者约有8000万，慢性乙型肝炎患者约2000万人，严重威胁人民健康。然而遗憾的是，现有的临床一线药物如药物核苷（酸）类似物及干扰素类药物等，均不具有直接清除cccDNA的作用，因而难以实现慢性乙型肝炎的临床治愈。因此，研发cccDNA靶向药物、寻找清除cccDNA的新策略，仍是我们努力的方向。
近年来，对基因组进行位点特异性切割或编辑的DNA编辑技术有了较快的发展，其中CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated system 9 proteins）已被尝试应用于靶向切割HBVcccDNA。该技术通过特定靶向RNA（guided RNA，gRNA）的设计，引导核酸酶在特定位点切割cccDNA，引入插入/缺失突变、或者导致cccDNA大片段缺失，从而破坏HBV基因组结构抑制HBV复制。我们及其他实验室的报道均证实CRISPR/Cas9技术可作为直接靶向清除cccDNA的潜在而有效的工具。近年来，随着腺病毒相关病毒载体靶向输送并特异性在肝细胞内表达CRISPR/Cas9的系列研究的完成，使该技术进一步完善，特别是对Cas核酸酶的改造，使其脱靶效应得到了有效控制，安全性大为提高。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种转录后基因沉默机制，其通过RNase Ⅲ家族的Drosha/DGCR8酶及Dicer酶将长双链RNA切割加工成小RNA，降解与其同源性的靶mRNA或抑制靶mRNA翻译，从而抑制靶基因表达。这方面的明星分子是ARC-520，其由两种siRNA（chol-siHBV-74、chol-siHBV-77）组成，通过RNAi机制靶向HBV RNA保守区域如病毒的各种mRNA及前基因组RNA（pregenome RNA，pgRNA）,从而阻断后续一系列蛋白质的合成，降低病毒载量及病毒相关抗原水平。目前，这一基于RNAi技术的药物研发已完成临床实验Ⅱa期实验，证实2 mg/kg剂量治疗早期可显著下调HBsAg。
新近的研究表明，HBV cccDNA的半衰期可能只有短短数月。由此推测，感染肝细胞内平均5~50个拷贝/细胞这一有效病毒复制所需cccDNA水平的维持
